1958년 - 노설과 레더버그: ‘하나의 세포, 하나의 항체’ 원리의 실험적 증거

이론은 있었지만, 세포 수준의 증거는 부족했습니다

1950년대 후반, 데이비드 탤미지와 프랭크 버넷은 면역 반응을 클론선택(clonal selection)이라는 개념으로 설명하기 시작했습니다. 항원은 새로운 특이성을 만들어 내는 형틀이 아니라, 이미 존재하던 세포 집단 가운데 자신과 맞는 세포를 선택하고 증식시킨다는 생각이었습니다.

이 설명은 강력했지만, 중요한 약점이 있었습니다. 개별 세포 하나가 실제로 어떤 항체를 만들어 내는지 직접 확인할 수 있는 방법이 거의 없었다는 점입니다. “하나의 세포는 하나의 항체 특이성만 만든다”는 명제는 클론선택설의 핵심이었지만, 당시에는 아직 실험적으로 붙잡기 어려웠습니다.

Nossal과 Lederberg의 질문

Nossal과 Lederberg는 이 문제를 매우 직접적으로 물었습니다. 한 개의 항체 형성 세포가 두 항원에 동시에 노출되면, 그 세포는 두 종류의 항체를 모두 만들 수 있을까요. 아니면 둘 중 하나만 만들까요.

이 질문은 단순해 보이지만, 사실상 클론선택설의 핵심을 시험하는 질문이었습니다. 만약 한 세포가 여러 특이성을 자유롭게 만들어 낸다면, 선택의 단위를 세포로 보는 이론은 힘을 잃게 됩니다. 반대로 한 세포가 하나의 특이성만 보인다면, 면역 반응의 기본 단위가 개별 세포 클론이라는 해석은 크게 힘을 얻게 됩니다.

공동저자인 Joshua Lederberg는 같은 해 세균 유전학 연구로 1958년 노벨 생리의학상을 받은 인물입니다. 이 논문은 미생물유전학의 언어와 면역세포의 언어가 만난 지점에 놓여 있습니다.

미세 물방울 안의 단일 세포

연구진은 성체 Wistar 랫드를 두 종류의 monophasic Salmonella 항원으로 동시에 면역했습니다. 원문에 따르면 사용한 균은 _Salmonella adelaide_와 _Salmonella typhi_였고, 두 균은 서로 다른 flagellar antigen을 지녔습니다. 항체 검출에는 항편모 항체가 세균 운동성을 멈추게 하는 specific immobilization 현상을 이용했습니다.

면역은 두 항원을 같은 비율로 섞어 양쪽 hind foot-pad에 주사하는 방식으로 진행했습니다. 보통 3주 간격으로 세 차례 면역했고, 세 번째 면역 3일 뒤 양쪽 popliteal lymph node를 꺼내 세포 현탁액을 만들었습니다. 세포는 세 번 세척해 free soluble antibody를 제거한 뒤 실험에 사용했습니다.

핵심은 단일 세포를 microdroplet에 분리하는 과정이었습니다. 연구진은 de Fonbrune의 oil chamber method를 변형해, 커버글라스 위에 10^-7-10^-6 mL 정도의 매우 작은 물방울을 만들고 이를 paraffin oil 속에 두었습니다. 방울마다 0-6개의 세포가 들어가도록 희석한 세포 현탁액을 사용했고, 각 방울의 세포 수를 나중에 기록했습니다. 정확히 한 세포만 넣는 micromanipulation도 가능했지만, 세포가 micropipette에 달라붙어 번거로웠다고 원문은 적습니다.

항체를 직접 본 것이 아니라 운동성 억제를 읽었다

세포가 들어간 oil chamber는 37도에서 4시간 배양되었습니다. 이후 각 물방울에 약 10마리의 살아 있는 세균을 넣고, 20분 뒤 현미경으로 세균의 운동성을 관찰했습니다. 모든 세균이 움직이지 않으면 “inhibition”으로 판정했고, 한 마리라도 움직이면 “no inhibition”으로 판정했습니다.

처음 한 혈청형을 immobilize한 단일세포 방울은, 다시 다른 혈청형의 세균을 넣어 두 번째 특이성도 시험했습니다. 이 설계 덕분에 같은 세포가 두 Salmonella에 대한 항체를 모두 만들었는지, 아니면 한쪽에만 반응했는지를 물을 수 있었습니다.

결과: 둘 다가 아니라 둘 중 하나

결과는 논문 제목만큼 짧고 강했습니다. 원문은 지금까지 456개의 단일 세포를 시험했고, 그중 228개는 한 균에 대해, 228개는 다른 균에 대해 시험했다고 보고합니다. 이 가운데 33개는 _S. adelaide_에 대해, 29개는 _S. typhi_에 대해 활성을 보였습니다. 그러나 두 균을 모두 immobilize한 단일 세포는 없었습니다.

따라서 동물 전체는 두 항원에 모두 반응할 수 있었지만, 검출 가능한 범위에서 개별 항체 형성 세포는 한쪽 항원에 대한 항체만 만드는 것으로 보였습니다. 논문은 “두 contrasting antigens로 자극된 동물에서 individual cells는 one species of antibody를 형성하는 경향이 있다”고 해석했습니다.

중요한 것은 저자들이 결론을 조심스럽게 제한했다는 점입니다. 그들은 낮은 수준의 다른 항체 생산을 완전히 배제할 수는 없다고 적었습니다. 또한 항체 형성 phenotype의 분리가 유전형 제한(genotypic restriction)을 반영하는지, 아니면 virus interference나 enzyme formation competition 같은 phenotype 수준의 효과와 더 비슷한지는 추가 연구가 필요하다고 보았습니다.

왜 이 논문이 중요했는가

이 논문은 면역학의 분석 단위를 바꾸었습니다. 그전까지 항체 반응은 혈청 전체의 성질로 이해되는 경우가 많았습니다. 그러나 이 연구 이후 연구자들은 항체 반응을 개별 세포 클론의 성질로 보기 시작합니다. 항체는 혈청이 막연히 만들어 내는 물질이 아니라, 특정 세포가 담당하는 산물이라는 인식이 훨씬 더 강해졌습니다.

또한 이 논문은 버넷의 1957년 clonal selection theory와 시간적으로도 거의 맞물려 있습니다. 버넷이 세포 클론의 선택이라는 이론적 틀을 제시한 직후, Nossal과 Lederberg는 그 이론에서 가장 논쟁적이었던 명제 가운데 하나를 실험으로 떠받쳤습니다. 그래서 이 논문은 결과 그 자체뿐 아니라, 이론과 실험이 처음 강하게 맞물리는 순간이라는 점에서도 의미가 큽니다.

후속 연구와 한계

후대 연구는 이 그림을 훨씬 더 정교하게 만들었습니다. Nossal 자신도 이후 단일세포 항체 형성 연구를 계속 확장했고, 1960년대와 1970년대에는 항체의 class, affinity, 그리고 결국 유전자 수준의 특이성 문제가 차례로 분석됩니다. 나중에는 V(D)J 재배열과 allelic exclusion이 밝혀지면서 “one cell-one antibody” 원리는 분자 수준의 설명까지 얻게 됩니다.

다만 1958년 논문을 오늘날의 지식으로 과장해 읽어서는 안 됩니다. 이 연구는 아직 B세포 수용체의 분자 구조를 알지 못하던 시대의 논문이었고, 후대의 light chain exclusion이나 heavy chain rearrangement 같은 기전을 직접 다룬 것은 아닙니다. 또한 이 실험이 검출한 세포는 아마도 짧은 시간 안에 항체를 분비할 수 있는 항체 형성 세포에 가까웠을 가능성이 큽니다.

따라서 이 논문의 공로는 모든 기전을 설명했다는 데 있지 않고, 세포 단위의 항체 특이성을 실험적으로 붙잡았다는 데 있습니다.

단일클론 항체와 클론 개념으로 이어진 영향

이후 면역학이 세포와 클론의 언어로 재편되면서, 항체를 만드는 세포를 개별적으로 다룬다는 생각은 자연스럽게 기술 혁신으로 이어집니다. 1975년 Köhler와 Milstein의 hybridoma 기술이 성공할 수 있었던 것도, 항체 특이성이 개별 세포 클론의 안정된 성질이라는 믿음이 이미 강해져 있었기 때문입니다.

다시 말해 Nossal과 Lederberg의 실험은 단일클론 항체 기술을 직접 만든 논문은 아니지만, 그 기술이 이론적으로 가능하다는 직관을 뒷받침하는 매우 이른 근거였습니다.

참고사항

이 논문이 더욱 흥미로운 이유는 저자들의 면면 때문이기도 합니다. Lederberg는 젊은 나이에 세균의 유전적 재조합을 밝힌 업적으로 현대 미생물유전학의 방향을 바꾼 인물이었고, 그 공로로 1958년 노벨생리의학상을 받았습니다. 반면 Nossal은 노벨상 수상자는 아니었지만, 이후 면역학에서 항체 형성 세포와 면역관용 연구를 깊이 있게 확장하며 매우 중요한 위치를 차지한 학자였습니다.

한 사람은 미생물과 유전의 언어를 대표했고, 다른 한 사람은 면역세포와 항체 반응의 언어를 밀고 나갔습니다. 그리고 이 둘이 만난 자리에서, “하나의 세포는 하나의 항체 특이성을 가진다”는 명제가 처음으로 강한 실험적 지지를 얻게 되었습니다.

참고문헌

• Nossal GJV, Lederberg J. Antibody production by single cells. Nature. 1958;181(4620):1419-1420. https://doi.org/10.1038/1811419a0
• Burnet FM. A modification of Jerne's theory of antibody production using the concept of clonal selection. Australian Journal of Science. 1957;20:67-69.
• Nossal GJV. One cell, one antibody: prelude and aftermath. Nature Immunology. 2007;8(10):1015-1017. https://doi.org/10.1038/ni1007-1015
• Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975;256:495-497. https://doi.org/10.1038/256495a0

부록: 원문 실험방법 요약

원문 방법론이 특이하기 때문에, 핵심 절차를 따로 남깁니다.

1. 두 개의 monophasic Salmonella를 사용했습니다. _S. adelaide_와 _S. typhi_는 서로 다른 flagellar antigen을 지녔고, 항편모 항체가 있으면 세균 운동성이 멈춥니다.

2. 성체 Wistar 랫드에 두 항원을 같은 비율로 섞어 양쪽 hind foot-pad에 0.25 mL씩 주사했습니다. 보통 3주 간격으로 세 차례 면역했고, 세 번째 면역 3일 뒤 popliteal lymph node를 꺼냈습니다.

3. 림프절 세포는 Earle's saline, pH 7.0 tris buffer, 20% normal rat serum 조건에서 현탁했고, 세 번 세척해 free soluble antibody를 제거했습니다.

4. 세포는 paraffin oil 속 microdroplet에 분리했습니다. 방울 부피는 10^-7-10^-6 mL였고, 희석 세포 현탁액을 사용해 방울마다 0-6개의 세포가 들어가게 했습니다. 정확히 한 세포만 넣는 micromanipulation도 가능했지만 더 번거로웠습니다.

5. 37도에서 4시간 배양한 뒤, 각 방울에 약 10마리의 세균을 넣었습니다. 20분 뒤 모든 세균이 움직이지 않으면 inhibition으로, 한 마리라도 움직이면 no inhibition으로 판정했습니다.

6. 대조군으로 배지, 마지막 세척 상청액, 배양 전 세포 현탁액, 세포 없는 방울, 비면역 랫드 세포를 확인했고, 이들은 세균 운동성 억제를 보이지 않았습니다. 두 혈청형에 대한 항혈청 사이의 교차반응도 negligible하다고 보고했습니다.

7. 단일세포 456개 중 33개는 S. adelaide, 29개는 _S. typhi_를 immobilize했지만, 둘 모두를 immobilize한 세포는 없었습니다. 이것이 이 논문의 핵심 결과입니다.