1988년 - IRF-1의 등장: IFN-β 조절 서열을 읽는 핵인자를 유전자로 붙잡다

핵심 요약

이 논문은 IFN-β 유전자 조절 서열에 결합하는 전사인자 IRF-1을 cDNA 수준에서 규명한 연구입니다. 저자들은 IFN-β enhancer의 반복 서열을 probe로 사용해 mouse L929 cDNA library에서 DNA 결합 clone을 찾았고, mouse IRF-1과 human counterpart를 클로닝했습니다.

IRF-1은 단순한 constitutive DNA-binding protein이 아니었습니다. IRF-1 mRNA는 Concanavalin A로 자극한 비장세포와 NDV 감염 L929 세포에서 유도되었고, 바이러스 감염 뒤 IRF-1 mRNA가 IFN-β mRNA보다 먼저 증가하는 양상을 보였습니다. 이 논문은 후대의 IRF3/IRF7 모델을 완성한 연구는 아니지만, 인터페론 유도를 전사인자와 조절 서열의 네트워크로 읽게 만든 출발점입니다.

인터페론은 어떻게 켜지는가

1957년 인터페론은 바이러스 간섭을 유도하는 세포 유래 인자로 발견되었습니다. 그러나 그 뒤 수십 년 동안 남아 있던 질문은 이것이었습니다. 세포가 바이러스나 poly(I:C) 같은 자극을 받았을 때, IFN-β 유전자는 실제로 어떤 분자에 의해 켜지는가.

1980년대 중반에는 IFN-β 유전자의 5' 조절 영역에 virus-inducible enhancer가 있다는 사실이 이미 알려져 있었습니다. 특히 CAP site 상류의 -65에서 -105 사이에는 반복적인 hexanucleotide motif가 있고, 이 서열이 바이러스 유도 전사 활성화에 중요하다는 점이 드러나 있었습니다. 하지만 DNA 조절 서열이 있다는 것과, 그 서열을 실제로 읽는 단백질을 분자적으로 붙잡았다는 것은 전혀 다른 문제입니다.

이 논문은 바로 그 단백질을 유전자 수준에서 붙잡은 연구입니다. 저자들은 IFN-β 조절 서열에 결합하는 핵인자를 IRF-1, 즉 interferon regulatory factor-1이라고 부르고, 그 cDNA를 클로닝해 단백질의 성격과 발현 조절을 분석했습니다.

cDNA library에서 DNA 결합 단백질을 역으로 찾다

실험의 출발점은 IFN-β 조절 서열 자체였습니다. 연구진은 IFN-β enhancer 안의 반복 hexamer 서열, 특히 AAGTGA motif가 반복된 C1 oligomer를 probe로 사용했습니다. 그리고 mouse L929 세포 유래 mRNA로 만든 λgt11 cDNA library를 이 DNA probe로 screening했습니다.

이 접근은 상당히 직접적입니다. 단백질을 먼저 정제한 뒤 유전자를 찾는 것이 아니라, 특정 DNA 서열에 결합하는 단백질을 발현하는 cDNA clone을 library 안에서 골라낸 것입니다. 약 140만 개 recombinant를 screening한 결과, 반복적으로 probe DNA에 결합하는 clone λL28-8이 분리되었습니다.

그다음 저자들은 이 clone이 정말 기존에 관찰된 IRF-1과 같은 성질을 갖는지 확인했습니다. 유도된 lysogen에서 얻은 단백질 추출물을 gel retardation assay에 넣었을 때, C1 oligomer와 결합하는 shifted band가 나타났고, 이 결합은 과량의 unlabeled C1 oligomer로 경쟁되었지만 관련 없는 C5A oligomer로는 잘 경쟁되지 않았습니다. 즉 이 단백질은 특정 IFN-β 조절 서열을 선택적으로 인식했습니다.

footprinting으로 IFN-β 조절 부위 결합을 확인하다

단순한 gel shift만으로는 부족합니다. 저자들은 DNase I footprinting으로 이 단백질이 IFN-β upstream regulatory region의 어느 부분을 보호하는지 확인했습니다. 결과적으로 clone에서 나온 단백질은 IFN-β 유전자 상류의 -100에서 -64 부근, 특히 AAGTGA motif가 포함된 영역을 보호했습니다.

이 패턴은 L929 세포에서 이미 관찰된 IRF-1의 결합 양상과 매우 비슷했습니다. 또 IFN-β 조절 부위에 돌연변이를 넣어 virus inducibility가 떨어지는 mutant DNA에서는 보호 양상도 달라졌습니다. 다시 말해 이 cDNA clone이 만든 단백질은 단순히 DNA에 붙는 일반 결합 단백질이 아니라, IFN-β 유도성 enhancer에서 기능적으로 중요한 서열을 인식하는 인자였습니다.

IRF-1은 IFN-β만 보는 단백질이 아니었다

경쟁 결합 실험은 IRF-1의 의미를 더 넓혔습니다. 저자들은 IFN-β 조절 서열뿐 아니라 IFN-α1, mouse H-2D d, ISG54, 2'-5' oligoadenylate synthetase 같은 유도성 유전자들의 조절 서열에도 유사한 motif가 있음을 비교했습니다. 특히 mouse H-2D d gene의 IFN response sequence와도 경쟁이 관찰되었습니다.

이 대목이 중요합니다. IRF-1은 IFN-β 하나만 켜는 단일 유전자 조절자가 아니라, 바이러스 또는 IFN에 의해 유도되는 여러 유전자의 조절 네트워크와 연결될 수 있는 인자로 떠오릅니다. 후대의 언어로 말하면, IRF-1은 인터페론 생물학을 단일 cytokine 생산의 문제가 아니라 항바이러스 유전자 프로그램의 문제로 바꾸는 출발점에 있었습니다.

단백질 구조: 새로운 종류의 DNA 결합 단백질

저자들은 mouse IRF-1 cDNA와 human counterpart cDNA를 분석해, IRF-1이 약 329개 아미노산으로 이루어진 단백질이라고 제시했습니다. 계산된 분자량은 약 37 kDa로, L929 세포 유래 IRF-1의 추정 크기와 잘 맞았습니다.

흥미로운 점은 IRF-1이 기존의 전형적 DNA binding motif, 예를 들어 zinc finger나 helix-turn-helix를 뚜렷하게 갖고 있지 않다는 점입니다. 대신 N말단 쪽에는 lysine과 arginine이 풍부한 basic region이 집중되어 있었고, 저자들은 이 영역이 DNA 결합에 중요할 가능성이 높다고 해석했습니다. 인간과 마우스 IRF-1을 비교했을 때도 특히 N말단 절반이 매우 강하게 보존되어 있었습니다. 이는 IRF-1이 기존에 익숙한 전사인자 계열과는 다른 새로운 DNA 결합 단백질군의 출발점일 수 있음을 시사했습니다.

IRF-1 자체도 유도되는 유전자였다

이 논문의 가장 중요한 결과 중 하나는 IRF-1이 단순히 항상 존재하는 조절자가 아니라는 점입니다. Northern blot 분석에서 IRF-1 mRNA는 여러 조직에서 낮은 수준으로 검출되었지만, Concanavalin A로 자극한 비장세포에서는 크게 증가했습니다. 또한 mouse L929 세포를 Newcastle disease virus(NDV)로 감염시키면 IRF-1 mRNA가 빠르게 유도되었습니다.

시간 순서도 중요했습니다. NDV 감염 후 IRF-1 mRNA는 약 3시간부터 증가하기 시작했고, IFN-β mRNA는 더 늦은 시점, 약 6시간 이후에 검출되었습니다. IRF-1 mRNA는 9-12시간에 높게 올라갔다가 이후 줄어드는 transient induction 양상을 보였습니다. 이 결과는 바이러스 자극이 먼저 IRF-1 유전자 발현을 유도하고, 그 뒤 IFN-β 전사와 다른 유도성 유전자 발현으로 이어질 수 있음을 시사합니다.

다만 여기서 조심할 점도 있습니다. 이 논문은 IRF-1이 IFN-β 유전자 조절에 중요한 인자라는 강한 근거를 제시했지만, 오늘날 우리가 아는 IRF3, IRF7 중심의 type I IFN 초기 유도 모델을 아직 갖고 있던 시기는 아닙니다. 따라서 이 논문을 “IFN-β 유도의 유일한 시작점”으로 읽으면 과합니다. 더 정확히는, IFN-β 조절 서열을 인식하고 바이러스 자극에 의해 유도되는 IRF 계열 전사조절자의 문을 연 논문입니다.

IRF-1 promoter도 바이러스에 반응했다

저자들은 한 걸음 더 나아가 IRF-1 유전자 자체의 promoter도 분석했습니다. IRF-1 promoter에는 전형적인 TATA box가 없었고, GC box와 CAAT box가 포함되어 있었습니다. 연구진은 IRF-1 promoter fragment를 CAT reporter와 연결해 L929 세포에 넣고, NDV 자극에 반응하는지 보았습니다.

결과적으로 IRF-1 promoter는 바이러스 자극에 의해 reporter 활성이 증가했고, upstream sequence를 삭제하면 constitutive expression과 induced expression이 모두 크게 줄었습니다. 이는 IRF-1 자체가 바이러스 유도성 조절 회로의 일부라는 점을 뒷받침합니다. 즉 인터페론 반응은 단순히 IFN-β 유전자가 켜지는 사건이 아니라, 그 유전자를 읽는 조절 인자의 유전자도 함께 조절되는 계층적 회로였습니다.

인터페론 연구에서의 의미

이 논문은 인터페론 연구의 초점을 물질에서 프로그램으로 옮겼습니다. 1957년 인터페론이 “세포가 만들어내는 항바이러스 인자”로 발견되었다면, 1988년 IRF-1 논문은 그 인자를 만들게 하는 전사조절 장치를 유전자 수준에서 붙잡은 사건입니다.

이후 인터페론 연구는 IRF family, JAK-STAT, ISGF3, ISG 프로그램으로 확장됩니다. 그 전체 역사 속에서 IRF-1 논문은 첫 번째 완성된 답이라기보다, 인터페론 반응을 “전사 인자와 조절 서열의 네트워크”로 읽기 시작하게 만든 전환점으로 보는 것이 가장 정확합니다.

한 줄 정리

IRF-1의 클로닝은 인터페론을 단순한 항바이러스 물질이 아니라, 바이러스 자극에 의해 켜지는 전사조절 네트워크의 산물로 이해하게 만든 결정적 전환점이었습니다.

참고문헌

• Miyamoto M, Fujita T, Kimura Y, Maruyama M, Harada H, Sudo Y, Miyata T, Taniguchi T. Regulated expression of a gene encoding a nuclear factor, IRF-1, that specifically binds to IFN-β gene regulatory elements. Cell. 1988;54(6):903-913. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(88)91307-4
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