1998년 - IRF3가 바이러스 신호를 type I 인터페론 전사로 잇다

핵심 요약

이 논문은 IRF3가 바이러스 감염 뒤 type I 인터페론 유전자 전사를 켜는 초기 전사 조절 인자로 작동할 수 있음을 보여 준 연구입니다. 저자들은 rat embryo fibroblast에서 IRF3를 과발현하면 IFNA4와 IFNB promoter의 활성이 증가하고, Newcastle disease virus, 즉 NDV 감염에 의한 promoter 활성화가 더 강해진다는 점을 보였습니다. 이 상승은 IFNA4 promoter에서 더 뚜렷해 바이러스 단독 조건보다 약 6-7배 높았고, IFNB promoter에서는 약 3-4배 높았습니다.

IRF3 과발현은 reporter promoter만이 아니라 endogenous IFN 생산도 늘렸습니다. NDV 감염 REF 세포에서 IRF3 과발현은 생물학적으로 측정한 IFN 생산을 약 2-3배 증가시켰고, IFNA RNA는 RT-PCR에서 약 5배 증가했으며, IFNB mRNA는 Northern blot에서 약 15배 증가했습니다. 반대로 C말단 phosphorylation site를 alanine으로 바꾼 IRF3(5A) mutant는 promoter 활성은 일부 남아 있었지만 endogenous IFN 생산을 증가시키지 못했습니다.

항바이러스 효과도 중요한 검증점이었습니다. IRF3를 2FTGH 세포에 과발현하면 VSV replication이 10배 이상 줄었지만, IFN signaling에 필요한 JAK1이 결손된 U4A 세포나 p48/ISGF3γ가 결손된 U2A 세포에서는 이런 보호 효과가 나타나지 않았습니다. 또한 IFNA와 IFNB 유전자가 없는 Vero 세포에서도 IRF3 과발현만으로 항바이러스 상태가 유도되지 않았습니다. 그래서 이 논문은 IRF3의 항바이러스 효과가 주로 IFN 유전자 유도와 그 뒤의 IFN signaling에 의해 매개된다고 결론 내렸습니다.

연구 배경 및 이 글에서 답하는 질문

바이러스 감염 뒤 type I 인터페론 유전자가 빠르게 켜진다는 사실은 오래전부터 알려져 있었습니다. IFN-β promoter의 경우 ATF2/c-Jun, NF-κB, IRF 계열 단백질, HMGY(I), CBP/p300 같은 구성 요소가 함께 작동하는 enhanceosome 모델이 제시되어 있었습니다. IFNA4 promoter에도 IRF-E와 AF-1 같은 바이러스 반응 cis-element가 필요하다는 점이 알려져 있었습니다.

그러나 어떤 IRF가 감염 초기 IFNA와 IFNB 유전자를 실제로 켜는지는 명확하지 않았습니다. IRF1은 자연스러운 후보였지만, IRF1 결손 마우스에서도 바이러스 매개 IFNA/IFNB 유도가 유지된다는 결과가 있었습니다. 또한 IFNA4 promoter의 IRF-E에 결합하는 virus-induced factor가 IRF1, IRF2, ISGF3γ와 다르다는 단서도 있었습니다.

IRF3는 이 빈칸을 채울 후보였습니다. IRF3 mRNA는 여러 조직과 세포에서 constitutive하게 발현되고, 바이러스 감염이나 IFN 처리로 그 transcription이 크게 증가하지 않습니다. 대신 감염 뒤 IRF3 단백질의 C말단이 phosphorylation되고, 핵 이동과 CBP/p300 결합이 촉진된다는 점이 당시 이미 보고되어 있었습니다. 이 논문은 그 단백질 변화가 실제 endogenous IFNA/IFNB gene transcription과 IFN 매개 항바이러스 상태로 이어지는지를 묻습니다.

이 논문의 핵심 논리

저자들은 먼저 IRF3가 promoter 수준에서 IFN 유전자 전사를 촉진할 수 있는지 보았습니다. REF 세포에 IFNA4-CAT 또는 IFNB-CAT reporter를 넣고 IRF3를 과발현하자, IRF3는 IFNA4 promoter 활성을 증가시켰습니다. NDV 감염을 더하면 효과는 단순 가산 이상으로 커졌습니다. IFNB promoter에서도 IRF3는 활성을 증가시켰지만, IFNA4 promoter에서보다 synergy는 작았습니다.

이 실험에서 IRF1은 양성 대조군, IRF2는 맥락에 따라 억제적 역할을 하는 대조군으로 쓰였습니다. 논문은 IRF3가 IRF1과 완전히 같은 역할을 한다고 주장하지 않습니다. 오히려 IRF1 결손에서도 IFN 유도가 유지되는 배경을 고려할 때, IRF3가 감염 초기 IFN promoter를 직접 강화할 수 있는 별도의 IRF 구성 요소라는 점을 강조합니다.

IRF3 mutant 실험은 activation domain과 phosphorylation의 역할을 분리해 보여 주었습니다. IRF3의 central proline-rich region을 지워도 IFNA/IFNB promoter 활성화 능력은 크게 손상되지 않았습니다. 반면 C말단 phosphorylation cluster를 바꾼 IRF3(5A)는 transactivation 능력이 약해졌습니다. 논문 discussion에서는 바이러스가 IRF3의 Ser-396, Ser-398, Ser-402, Ser-405, Thr-404 부근을 phosphorylation한다고 정리하고, 이 site들을 바꾸면 transient reporter assay에서 transactivation이 약 50% 줄고 endogenous IFN synthesis 증가는 사라진다고 설명합니다.

Endogenous IFN 유도

Reporter assay는 promoter 조각의 반응을 보여 주지만, 실제 세포 안의 IFN gene이 켜지는지를 말해 주지는 않습니다. 그래서 저자들은 REF 세포에 IRF3를 과발현하고 NDV로 감염한 뒤 배지의 생물학적 IFN 활성을 측정했습니다. IRF3 과발현 세포에서는 IFN 생산이 control보다 약 2-3배 증가했습니다. transient transfection 조건에서 실제로 plasmid를 받은 세포가 25-30% 정도였다는 점을 고려하면, 저자들은 이 증가가 과소평가되었을 수 있다고 보았습니다.

RNA 분석도 같은 방향이었습니다. IRF3 과발현 REF 세포에서 NDV 감염 뒤 IFNA RNA는 RT-PCR 기준 약 5배 증가했고, IFNB mRNA는 Northern blot 기준 약 15배 증가했습니다. 이 결과는 IRF3가 단순히 artificial reporter만 켜는 단백질이 아니라, 감염된 fibroblast 안에서 endogenous IFNA와 IFNB gene induction을 강화한다는 점을 보여 줍니다.

다만 이 결론은 세포 종류와 IFN subtype에 따라 조심해서 읽어야 합니다. 저자들은 IRF3 과발현만으로 fibroblast의 낮은 IFNA expression이 B cell이나 macrophage 감염 때 보이는 수준까지 올라가지는 않았다고 언급했습니다. 따라서 IRF3는 IFN 생산량을 제한하는 중요한 인자일 수 있지만, IFNA gene family 전체의 강한 유도에는 다른 세포 특이적 전사인자와의 협력이 필요할 수 있습니다. 이 점은 이후 IRF7의 역할이 정리되는 흐름과 잘 맞습니다.

항바이러스 효과는 IFN에 의존하는가

IRF3는 ISG15 promoter를 활성화할 수 있다는 이전 결과가 있었기 때문에, IRF3의 항바이러스 효과가 IFN 없이 직접 ISG를 켜서 나타나는지, 아니면 IFN을 만들고 그 IFN이 다시 JAK-STAT 경로를 통해 항바이러스 상태를 만드는지가 중요한 질문이었습니다.

저자들은 2FTGH 세포와 그 mutant 세포들을 이용해 이 문제를 구분했습니다. 정상 2FTGH 세포에 IRF3를 과발현하면 VSV replication이 10배 이상 감소했습니다. 그러나 p48/ISGF3γ가 결손되어 ISGF3 복합체를 만들지 못하는 U2A 세포, JAK1 기능이 결손된 U4A 세포에서는 IRF3 과발현이 VSV replication을 억제하지 못했습니다. 두 mutant 모두 IFN의 항바이러스 효과에 반응하지 못하는 세포입니다.

또한 IFNA와 IFNB 유전자가 없는 Vero 세포에서도 IRF3 과발현은 항바이러스 상태를 만들지 못했습니다. Vero 세포는 외부 IFN에는 반응할 수 있고, 바이러스 감염 신호가 exogenous IFNB promoter를 활성화할 수는 있지만, endogenous IFNA/IFNB gene 자체가 없습니다. 따라서 이 결과는 IRF3가 항바이러스 상태를 만들려면 IFN 유전자 유도와 그 뒤의 IFN signaling이 필요하다는 해석을 강하게 뒷받침합니다.

이 부분은 기존 글에서 특히 중요합니다. IRF3는 “바이러스를 직접 막는 단백질”이라기보다, type I IFN을 만들게 하고 그 IFN이 주변 신호전달 회로를 통해 항바이러스 유전자 프로그램을 켜게 하는 상위 전사 조절 인자로 이해하는 것이 정확합니다.

CBP/p300과 E1A

논문은 IRF3가 어떻게 강한 transcriptional activation으로 이어지는지도 다룹니다. 바이러스 감염 뒤 IRF3 C말단 phosphorylation은 CBP/p300 coactivator와의 결합을 촉진하는 것으로 알려져 있었고, 이 논문은 그 연결이 IFNA4 promoter activation에 중요함을 보여 주었습니다.

가장 분명한 실험은 adenovirus E1A입니다. 293 세포에서는 IRF3가 IFNA/IFNB promoter를 잘 transactivate하지 못하는데, 이 세포는 adenovirus E1A를 발현합니다. 저자들은 REF 세포에서 E1A를 함께 발현시키면 IRF3가 IFNA4 promoter를 활성화하는 효과가 약 94% 억제된다는 점을 보였습니다. 반면 p300에 결합하지 못하는 E1A mutant는 이런 억제를 보이지 않았습니다.

또한 p300을 더 많이 발현시키면 E1A에 의한 억제가 부분적으로 회복되었고, IRF3와 상호작용하는 CBP C말단 fragment를 넣으면 IRF3-mediated IFNA4 activation이 억제되었습니다. E1A가 IRF3 단백질 자체를 분해시키는 것은 아니었습니다. 그래서 저자들은 E1A와 IRF3가 제한된 CBP/p300 coactivator를 두고 경쟁할 수 있으며, adenovirus가 이 방식으로 IFN 유전자 transcription을 낮출 수 있다고 해석했습니다.

이 발견은 바이러스 회피를 단순히 “IFN signaling 차단”으로만 보지 않게 합니다. 바이러스 단백질은 IFN이 만들어진 뒤의 JAK-STAT 반응을 방해할 수도 있지만, 그보다 앞 단계인 IFN gene transcription 자체를 coactivator 수준에서 눌러 버릴 수도 있습니다.

왜 중요한가

이 논문은 type I 인터페론 유도의 시작점을 더 구체적으로 만들었습니다. 1990년 IFNAR1 연구와 1992-1993년 ISGF3/JAK-STAT 연구는 IFN이 만들어진 뒤 세포가 그 신호를 어떻게 읽는지를 설명했습니다. Juang 등의 1998년 논문은 그보다 앞쪽, 즉 바이러스 감염 세포가 IFNA와 IFNB gene transcription을 어떻게 올리는지에 IRF3를 배치했습니다.

또한 이 연구는 IRF3를 단일 “마스터 스위치”로 과장하지 않고도 충분히 중요합니다. IRF3는 constitutive하게 준비되어 있다가 바이러스 감염 뒤 post-translational modification을 통해 빠르게 활성화됩니다. 새 단백질을 많이 합성해야만 반응하는 시스템이 아니라, 이미 존재하던 전사인자를 phosphorylation, nuclear localization, CBP/p300 recruitment로 전환해 빠르게 IFN 유전자 발현을 시작하는 시스템입니다.

그리고 이 논문은 type I IFN induction과 IFN response를 하나의 회로로 연결합니다. IRF3는 IFN genes를 켜고, 생성된 IFN은 JAK-STAT-IRF9 경로를 통해 ISG를 켜며, 그 결과 항바이러스 상태가 만들어집니다. 2FTGH mutant와 Vero cell 실험은 이 회로가 끊어지면 IRF3 과발현만으로는 충분한 항바이러스 보호가 생기지 않는다는 점을 보여 주었습니다.

인터페론 개발사 / 면역과 연결하면

인터페론의 역사는 크게 세 단계로 읽을 수 있습니다. 먼저 바이러스 간섭 현상과 IFN 단백질이 발견되었고, 다음으로 IFN 수용체와 JAK-STAT 신호전달이 정리되었으며, 그 뒤 바이러스 감염이 IFN 유전자 자체를 어떻게 켜는지가 분자적으로 설명되기 시작했습니다. 이 논문은 세 번째 단계에서 IRF3를 핵심 위치에 올려놓은 연구입니다.

면역학적으로 중요한 점은 세포가 바이러스를 만나면 두 개의 전사 프로그램을 순차적으로 작동시킨다는 것입니다. 첫 번째 프로그램은 감염 세포 안에서 IRF3, NF-κB, AP-1, CBP/p300 같은 인자들이 IFN 유전자를 켜는 단계입니다. 두 번째 프로그램은 분비된 IFN이 주변 세포와 자기 자신에게 작용해 JAK-STAT 경로로 ISG를 유도하는 단계입니다. IRF3는 그 첫 번째 단계의 중요한 전사 조절 인자입니다.

이 관점은 치료적으로도 중요합니다. IFN을 약으로 투여하는 것은 두 번째 단계, 즉 IFN response를 직접 자극하는 방식입니다. 반면 IRF3 축을 이해하는 것은 세포가 언제, 어디서, 얼마나 IFN을 만들지 조절하는 문제와 연결됩니다. 항바이러스 면역을 강화하려면 IFN 자체만이 아니라 IFN을 유도하는 전사 회로와 바이러스가 그 회로를 막는 방식을 함께 봐야 합니다.

한 줄 정리

1998년 Juang 등은 IRF3가 바이러스 감염 신호를 IFNA/IFNB 전사와 IFN 의존 항바이러스 상태로 연결하는 초기 전사 조절 인자임을 보여 주었습니다.

참고문헌

• Juang Y-T, Lowther W, Kellum M, Au W-C, Lin R, Hiscott J, Pitha PM. Primary activation of interferon A and interferon B gene transcription by interferon regulatory factor 3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1998;95(17):9837-9842. doi:10.1073/pnas.95.17.9837