1992년 - ISGF3γ 클로닝: IRF9의 정체가 드러나다

핵심 요약

이 논문은 IFN-α 반응 전사인자인 ISGF3가 어떤 소단위로 DNA를 읽는지를 분자 수준에서 규명한 연구입니다. 저자들은 ISGF3γ 활성을 48 kDa로 이동하는 단백질과 연결했고, 정제한 단백질의 부분 아미노산 서열을 이용해 cDNA를 클로닝했습니다. 클로닝된 ISGF3γ는 시험관 번역 산물만으로도 full-length ISRE에 특이적으로 결합했고, IFN-α 처리 HeLa 세포에서 얻은 ISGF3α와 만나 성숙한 ISGF3 DNA 결합 복합체를 만들었습니다.

서열 분석에서는 ISGF3γ의 N말단 117개 아미노산이 IRF1, IRF2, ICSBP 같은 IRF family 단백질의 DNA 결합 영역과 유의하게 닮아 있었습니다. 저자들은 이 영역이 c-Myb의 DNA 결합 반복 구조와도 일부 유사하다고 보았지만, 이것은 직접적인 기능 증명이 아니라 DNA 인식에 공통 구조 모티프가 쓰일 수 있다는 서열 기반 해석입니다. 오늘날의 이름으로 말하면, 이 논문은 ISGF3 복합체의 DNA 인식 소단위인 IRF9를 붙잡은 논문입니다.

연구 배경 및 이 글에서 답하는 질문

1980년대 말에는 IFN-α가 세포 표면 수용체를 통해 신호를 보내고, 그 결과 IFN-stimulated response element, 즉 ISRE를 가진 유전자들이 빠르게 켜진다는 사실이 알려져 있었습니다. 이 반응을 매개하는 양성 전사인자는 ISGF3라고 불렸고, IFN-α 처리 뒤 세포질에서 활성화되어 핵으로 이동하는 잠재적 전사 조절 인자로 이해되고 있었습니다.

하지만 ISGF3 자체가 하나의 단백질인지, 여러 단백질의 복합체인지, 그중 어느 부분이 DNA 서열을 직접 읽는지는 완전히 정리되어 있지 않았습니다. 이전 연구들은 ISGF3가 ISGF3α와 ISGF3γ라는 두 구성 요소로 나뉘며, ISGF3α는 84, 91, 113 kDa 크기의 여러 polypeptide와 관련되고, ISGF3γ는 약 48 kDa DNA 결합 성분일 가능성을 제시했습니다. 이 논문은 그 가능성을 단백질 정제, peptide sequencing, cDNA cloning, in vitro translation으로 직접 검증했습니다.

이 논문이 묻는 질문은 단순합니다. IFN-α 반응에서 ISRE를 직접 인식하는 ISGF3의 소단위는 무엇이며, 그 단백질은 이미 알려진 전사인자 계열과 어떤 관계를 갖는가?

이 논문의 핵심 논리

저자들은 ISGF3γ를 유전자 이름에서 출발해 찾지 않았습니다. 먼저 HeLa 세포 추출물에서 ISRE에 결합하고 ISGF3α와 함께 ISGF3 복합체를 만들 수 있는 활성을 따라갔습니다. 특히 IFN-γ 처리는 ISGF3γ의 양을 늘려 이후 IFN-α 반응을 강화하는 것으로 알려져 있었기 때문에, 저자들은 IFN-γ 처리 HeLa 세포의 세포질 추출물을 중요한 출발 물질로 사용했습니다.

정제 과정에서 ISGF3γ 활성은 약 7,000배 농축되었고, SDS gel에서 35-60 kDa 범위의 단백질들을 잘라 다시 접히게 한 뒤 gel shift assay로 확인했을 때 대부분의 활성이 48 kDa band에서 회수되었습니다. 이 실험은 48 kDa 단백질이 단순히 ISGF3γ와 같이 움직이는 오염 단백질이 아니라, ISRE 결합 활성과 직접 연결된 단백질임을 보여 주었습니다.

그 다음 단계는 단백질을 유전자로 바꾸는 일이었습니다. 저자들은 IFN-γ와 IFN-α로 처리한 HeLa 세포 핵 추출물에서 ISGF3 복합체를 더 정제하고, SDS-PAGE로 분리한 48 kDa ISGF3γ band를 잘라 trypsin으로 처리한 뒤 내부 peptide 서열을 얻었습니다. 이 peptide 서열을 바탕으로 degenerate primer를 설계했고, IFN-γ 처리 HeLa 세포 mRNA에서 reverse PCR을 수행해 cDNA 조각을 얻었습니다. 그 조각으로 cDNA library를 스크리닝해 ISGF3γ clone들을 확보했습니다.

클로닝된 단백질은 무엇이었나

가장 중요한 재구성 산물은 clone 38과 clone 48을 이어 만든 1,618 nt composite cDNA였습니다. 이 cDNA는 393개 아미노산, 예측 분자량 약 44 kDa의 단백질을 암호화했습니다. 실험에서 관찰된 HeLa ISGF3γ는 SDS-PAGE에서 약 48 kDa로 이동했기 때문에, 논문은 이 단백질을 48 kDa ISGF3γ polypeptide로 추적했습니다.

이 cDNA가 실제 ISGF3γ를 암호화한다는 검증은 두 방향에서 이루어졌습니다. 첫째, clone 38에서 만든 RNA를 rabbit reticulocyte lysate에서 번역하면 HeLa 세포에서 얻은 ISGF3γ와 구별하기 어려운 크기의 단백질이 만들어졌고, 이 단백질은 full-length ISRE probe에 결합했습니다. 둘째, 이 결합은 같은 ISRE oligonucleotide로는 경쟁되었지만 mutated ISRE나 IRF1이 잘 인식하는 core oligonucleotide로는 잘 경쟁되지 않았습니다. 따라서 클로닝된 단백질의 DNA 결합 특이성은 정제한 HeLa ISGF3γ와 일치했습니다.

또 하나 중요한 검증은 ISGF3α와의 결합이었습니다. In vitro에서 만든 ISGF3γ에 IFN-α 처리 HeLa 세포에서 분리한 ISGF3α를 더하면, gel shift assay에서 성숙한 ISGF3 DNA 결합 복합체가 형성되었습니다. mock translation에서는 이런 복합체가 의미 있게 생기지 않았습니다. 그래서 이 cDNA 산물은 단순한 ISRE 결합 단백질이 아니라, ISGF3α와 결합해 ISGF3 복합체를 구성하는 ISGF3γ라고 해석할 수 있었습니다.

DNA 결합 영역과 IRF family

서열 분석에서 가장 눈에 띈 부분은 N말단이었습니다. ISGF3γ의 N말단 117개 아미노산은 IRF1, IRF2, ICSBP와 유사했고, 특히 ICSBP와는 이 영역에서 59% identity를 보였습니다. IRF1과 IRF2와의 identity는 더 낮았지만, DNA 결합 단백질로서 같은 계열로 묶을 수 있을 정도의 보존성이 있었습니다.

이 결과는 ISGF3γ가 완전히 새로운 종류의 DNA 결합 단백질이 아니라, 인터페론 반응과 관련된 IRF family의 한 구성원임을 시사했습니다. 다만 ISGF3γ의 DNA 결합 특이성은 IRF1/IRF2와 같지 않았습니다. ISGF3γ는 IFN-stimulated gene promoter의 full-length ISRE를 선호했고, IRF1이 인식하는 core sequence와는 구별되는 결합 특성을 보였습니다. 따라서 이 논문의 결론은 “ISGF3γ가 IRF family와 닮았다”이지, “ISGF3γ가 IRF1과 같은 기능을 한다”가 아닙니다.

N말단의 중요성도 실험적으로 드러났습니다. clone 48은 두 번째 methionine에서 시작하는 짧은 산물을 만들었고, 이 산물은 DNA에 결합하지 못했습니다. 반대로 더 긴 N말단을 가진 clone 38 산물은 ISRE에 결합했습니다. 이 차이는 ISGF3γ의 맨 앞부분이 DNA 인식에 필요하다는 해석을 뒷받침했습니다.

Myb와의 연결은 어디까지인가

논문 제목에는 Myb family도 함께 등장하지만, 이 부분은 IRF family와의 관계보다 조심해서 읽어야 합니다. 저자들은 ISGF3γ와 IRF family의 보존 영역을 c-Myb의 DNA 결합 domain을 이루는 불완전한 tryptophan repeat와 비교했고, 일부 tryptophan과 hydrophobic residue의 배열이 닮아 있다고 보았습니다.

이 관찰에서 저자들이 끌어낸 결론은 기능적 동일성이 아니라 구조적 가능성입니다. 즉 ISGF3γ, IRF 단백질, c-Myb가 DNA를 읽을 때 서로 관련된 구조 모티프를 사용할 수 있다는 제안입니다. 이 문장을 오늘의 관점에서 쓸 때도 “Myb와 같은 단백질이다”라고 쓰면 과장이고, “Myb DNA 결합 영역과 서열상 닮은 점이 있어 공통 구조 모티프 가능성을 제시했다”라고 쓰는 것이 정확합니다.

인터페론 신호전달에서의 의미

이 논문은 IFN-α 신호가 수용체에서 끝나는 사건이 아니라, 세포질에서 활성화된 전사 복합체가 핵 안의 DNA 서열을 읽는 사건으로 이어진다는 점을 분자적으로 구체화했습니다. ISGF3γ는 이 복합체에서 “어떤 DNA 서열을 읽을 것인가”를 결정하는 소단위였고, ISGF3α는 IFN-α 신호에 의해 활성화되어 ISGF3γ와 결합하는 조절 성분으로 작동했습니다.

여기서 중요한 점은 IFN-α의 초기 전사 반응이 새로운 단백질 합성에 전적으로 의존하는 느린 과정이 아니라는 것입니다. 논문 배경에 따르면 ISGF3 활성화는 세포질에서 일어나고, 활성화된 factor가 핵으로 이동합니다. 동시에 이 논문은 IFN-γ 또는 IFN-α 처리로 ISGF3γ mRNA와 단백질 양이 증가할 수 있음을 보여 주었습니다. 따라서 즉각적인 IFN-α 반응에서는 기존 구성 요소의 활성화와 조립이 중요하고, IFN-γ priming이나 장기적 조절에서는 ISGF3γ abundance 자체가 반응 크기를 바꾸는 요소가 됩니다.

이 관점은 이후 JAK-STAT 경로와 자연스럽게 이어집니다. 오늘날 ISGF3는 STAT1, STAT2, IRF9로 이루어진 복합체로 이해됩니다. 1992년 논문은 아직 STAT라는 이름이 표준화되기 직전의 문헌이지만, ISGF3γ가 현재의 IRF9에 해당하는 DNA 인식 소단위라는 점을 확립해 이후 “수용체-JAK-STAT-IRF9-ISRE”로 이어지는 type I 인터페론 회로의 핵심 조각을 제공했습니다.

왜 중요한가

이 연구의 역사적 가치는 ISGF3라는 활성을 실제 유전자로 연결했다는 데 있습니다. 이전까지 ISGF3는 IFN-α 처리 뒤 나타나는 gel shift band이자 전사 활성과 상관되는 factor였습니다. Veals 등은 그 안에서 DNA를 직접 읽는 구성 요소를 정제하고, peptide sequence를 얻고, cDNA를 클로닝하고, 다시 시험관에서 단백질을 만들어 같은 DNA 결합과 복합체 형성을 재현했습니다.

또한 이 논문은 인터페론 반응을 개별 전사인자 하나의 문제가 아니라 복합체 조립의 문제로 보게 만들었습니다. ISGF3γ 혼자도 ISRE를 인식할 수 있지만, ISGF3α와 결합하면 성숙한 ISGF3 복합체가 됩니다. 이 구조는 신호를 받은 세포가 기존 단백질들의 상태와 조합을 바꾸어 빠르게 유전자 발현을 전환한다는 JAK-STAT식 사고방식과 잘 맞습니다.

인터페론 개발사 / 면역과 연결하면

1957년 인터페론 발견은 바이러스 감염 세포가 주변 세포에 항바이러스 상태를 전달한다는 현상을 보여 주었습니다. 1990년 IFNAR1 클로닝은 그 신호를 세포 표면에서 읽는 수용체 사슬을 붙잡았습니다. 1992년 Veals 논문은 그 신호가 핵 안에서 어떤 DNA 인식 장치를 통해 유전자 발현으로 바뀌는지를 보여 주었습니다.

면역학적으로 보면 이 논문은 인터페론을 “항바이러스 물질”에서 “전사 프로그램을 켜는 신호 체계”로 옮겨 놓는 데 기여했습니다. IFN-α가 세포를 자극하면 수용체와 세포질 신호전달만으로 끝나지 않고, ISGF3γ/IRF9가 포함된 복합체가 ISRE를 읽어 항바이러스 유전자들의 발현을 유도합니다. 그래서 ISGF3γ는 인터페론 반응에서 DNA 주소를 지정하는 단백질로 이해할 수 있습니다.

한 줄 정리

1992년 Veals 등은 ISGF3의 DNA 인식 소단위인 ISGF3γ, 곧 지금의 IRF9를 클로닝해 type I 인터페론 신호가 ISRE 전사 프로그램으로 연결되는 분자적 고리를 제시했습니다.

참고문헌

• Veals SA, Schindler C, Leonard D, Fu X-Y, Aebersold R, Darnell JE Jr, Levy DE. Subunit of an Alpha-Interferon-Responsive Transcription Factor Is Related to Interferon Regulatory Factor and Myb Families of DNA-Binding Proteins. Molecular and Cellular Biology. 1992;12(8):3315-3324. doi:10.1128/MCB.12.8.3315-3324.1992