1965년 - Hilschmann과 Craig: 항체 light chain에서 변하는 부분과 보존되는 부분을 보다

구조 다음에 남은 질문

1959년 Edelman과 Porter의 연구로 항체가 heavy chain과 light chain으로 이루어진다는 큰 구조는 보였습니다. 그러나 그 구조만으로는 항체의 핵심 문제가 풀리지 않았습니다. 항체는 어떻게 수많은 항원을 구별하면서도, 동시에 같은 계열의 면역글로불린으로 묶일 수 있을까요.

이 질문을 풀기 위해서는 항체를 단순히 자르는 것만으로는 부족했습니다. 실제 아미노산 서열을 비교해, 어느 부분이 항체마다 달라지고 어느 부분이 보존되는지를 봐야 했습니다.

왜 하필 Bence-Jones protein이었나

이 논문의 출발점은 Bence-Jones protein이 단순한 병적 단백질이 아니라, 다발성 골수종 환자의 myeloma globulin과 연결된 light chain이라는 사실이 점점 분명해지고 있었다는 데 있습니다. Edelman과 Poulik, Edelman과 Gally, Putnam, Kunkel 등의 연구를 통해 Bence-Jones protein은 같은 환자의 myeloma protein을 환원·알킬화했을 때 나오는 light chain과 대응한다고 해석되었습니다.

이 점이 중요합니다. 일반 혈청 항체는 수많은 B세포 클론이 만든 항체가 섞인 다클론 혼합물입니다. 그런 재료로는 서열을 읽어도 평균값만 보입니다. 반면 골수종은 하나의 클론이 과도하게 증식한 상태이므로, Bence-Jones protein은 사실상 하나의 항체 light chain을 대량으로 제공하는 셈이었습니다.

Hilschmann과 Craig는 그래서 heterogeneity가 적은 환자 시료를 골랐습니다. 논문에서 Roy와 Cummings는 연구에 사용된 다발성 골수종 환자 또는 그 환자에서 얻은 Bence-Jones protein 시료를 가리키는 식별명입니다. 특히 Roy 시료는 순도와 면역학적 성질이 잘 조사되어 있었고, 이 논문의 중심 재료가 됩니다. Cummings 시료는 분석이 덜 완성되었지만, Roy와 비교했을 때 어디가 같고 어디가 다른지를 보여 주기에 충분했습니다.

Roy 환자 시료의 단백질을 조각내다

오늘날에는 단백질 서열을 기계가 바로 읽어 주지만, 1965년의 작업은 훨씬 느리고 물리적이었습니다. 연구진은 Roy 환자에서 얻은 Bence-Jones protein을 mercaptoethanol로 환원하고 iodoacetic acid로 알킬화한 뒤, trypsin, chymotrypsin, pepsin으로 절단했습니다. 그런 다음 ion-exchange chromatography와 재분획을 반복해 peptide 조각을 하나씩 분리했습니다.

Roy 단백질의 아미노산 조성은 trypsin 절단으로 20개의 peptide가 나올 것으로 예측되었습니다. 논문은 실제로 그 20개 tryptic peptide를 모두 분리했고, 이 조각들의 합이 전체 단백질 조성과 맞는다는 점을 확인했습니다. 전체 길이는 212개 아미노산으로 계산되었고, 일부 자료에 따라 213개일 가능성도 언급됩니다.

이것은 단순한 기술적 성취가 아닙니다. 항체 light chain 하나를 거의 전체 길이에 걸쳐 peptide map으로 붙잡았다는 뜻입니다. 이 지도 위에서 연구진은 각 peptide의 N-말단과 C-말단 아미노산, 그리고 chymotryptic/peptic peptide와의 겹침을 이용해 조각들의 순서를 배열했습니다.

Cummings와 비교하자 그림이 보였다

결정적인 부분은 Roy 하나의 지도에서 끝나지 않았다는 점입니다. 연구진은 Cummings라는 다른 환자의 Bence-Jones protein도 함께 분석했습니다. Cummings는 Roy와 같은 antigenic type I에 속했지만, 유전적 marker와 individual antigenic specificity가 달랐고, 전체 아미노산 조성도 달랐습니다.

예상대로 Cummings의 N-말단 쪽 peptide들은 Roy와 상당히 달랐습니다. 그러나 C-말단 절반에서는 전혀 다른 그림이 나왔습니다. 논문은 Roy의 106번부터 212번까지에 해당하는 영역이 Cummings에도 거의 같은 순서로 존재하는 것으로 보인다고 해석했습니다. 차이는 189번 위치의 Val-Leu 치환 정도로 작았습니다.

반대로 N-말단 절반에서는 Roy의 tryptic peptide들이 Cummings에서 그대로 대응되지 않았습니다. 즉 같은 type I Bence-Jones protein이라도 앞쪽 절반은 크게 달라지고, 뒤쪽 절반은 거의 보존되는 패턴이 드러났습니다.

변하는 앞부분, 보존되는 뒷부분

이 논문은 현대 용어로 말하면 항체 light chain의 variable region과 constant region을 서열 수준에서 보여 준 초기 증거입니다. 저자들은 오늘날처럼 V region, C region이라는 완성된 언어를 사용하지는 않았지만, 결과의 방향은 분명했습니다. N-말단 절반은 개인별·클론별 차이가 크고, C-말단 절반은 같은 type 안에서 거의 보존됩니다.

이 관찰은 곧 variable region과 constant region이라는 개념으로 정리됩니다. 항원 결합의 다양성은 주로 variable region에서 나오고, 면역글로불린이라는 공통 구조와 기능은 constant region이 담당한다는 생각입니다.

왜 이것이 중요했는가

이 발견은 항체 다양성의 문제를 더 날카롭게 만들었습니다. 항체 한 사슬 안에 서로 성격이 다른 두 영역이 붙어 있다면, 유전자는 이것을 어떻게 만들까요. 하나의 유전자가 처음부터 variable과 constant 부분을 모두 품고 있는 것일까요, 아니면 서로 다른 유전자 조각이 어떤 방식으로 결합하는 것일까요.

바로 이 지점에서 Dreyer와 Bennett의 "paradox" 논문이 등장합니다. Hilschmann과 Craig가 단백질 서열에서 문제를 보여 주었다면, Dreyer와 Bennett은 그 문제를 유전자 조합의 문제로 바꾸어 표현했습니다.

여기서 중요한 것은 Hilschmann과 Craig가 도네가와식 유전자 재배열을 증명한 것은 아니라는 점입니다. 이 논문은 DNA를 직접 보지 않았습니다. 대신 단백질 서열이 이미 유전학적 질문을 강요한다는 것을 보여 주었습니다. 하나의 light chain 안에서 "심하게 달라지는 앞부분"과 "거의 보존되는 뒷부분"이 이어져 있다면, 그 구조를 만드는 유전자 체계도 평범하지 않을 가능성이 컸습니다.

저자들은 얼마나 조심스러웠나

논문 마지막 부분은 흥미롭게도 매우 조심스럽습니다. 저자들은 Roy, Cummings, 그리고 Putnam 연구진의 Ag 단백질 자료를 비교하면서, C-말단 쪽은 거의 동일하거나 단일 아미노산 치환 수준의 차이만 보일 수 있다고 말합니다. 반면 N-말단 쪽의 공통 부분은 훨씬 더 다양한 변이를 보입니다.

이때 Smithies가 제안한 면역글로불린 다양성 가설도 언급됩니다. 개별 면역글로불린의 차이가 유전자 사이 crossing-over로 설명될 수 있고, 심지어 그 과정이 somatic mutation처럼 일어날 수도 있다는 생각입니다. 그러나 Hilschmann과 Craig는 자기 자료만으로는 유효한 결론을 내리기에는 아직 fragmentary하다고 분명히 선을 긋습니다.

이 절제된 태도 때문에 논문이 더 중요합니다. 저자들은 항체 다양성의 최종 기전을 선언하지 않았습니다. 대신 단백질 서열 자료가 어디를 가리키는지 보여 주었습니다. 그 방향은 결국 variable/constant 구조, somatic change, 그리고 항체 유전자 재배열 문제였습니다.

도네가와로 이어지는 다리

1976년 도네가와의 항체 유전자 재배열 실험은 갑자기 나온 것이 아니었습니다. 그 앞에는 항체 단백질 자체가 이미 "변하는 부분"과 "보존되는 부분"으로 나뉜다는 서열 증거가 있었습니다.

따라서 Hilschmann과 Craig의 논문은 1959년 구조 연구와 1976년 유전자 재배열 연구 사이에 놓이는 중요한 고리입니다. 항체는 단순한 Y자형 단백질이 아니라, 다양성과 공통성을 한 사슬 안에 함께 담고 있는 분자였습니다.

도네가와가 훗날 보여 준 것은 이 단백질 수준의 구분이 DNA 수준의 V와 C 유전자 배열 변화와 연결된다는 사실이었습니다. Hilschmann과 Craig는 그 결론을 직접 말하지 않았지만, 그 결론이 필요해지는 단백질 지도를 만들어 놓았습니다.

한 줄 정리

Hilschmann과 Craig의 1965년 연구는 Bence-Jones light chain의 N-말단 절반은 크게 달라지고 C-말단 절반은 보존된다는 사실을 peptide map 비교로 보여 주며, 항체 다양성의 유전학적 설명을 준비했습니다.

참고문헌

• Hilschmann N, Craig LC. Amino Acid Sequence Studies with Bence-Jones Proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1965;53(6):1403-1409. https://doi.org/10.1073/pnas.53.6.1403
• Hilschmann N, Craig LC. Structural studies with Bence-Jones proteins. Biochemistry. 1965;4(1):5-17.
• Titani K, Putnam FW. Immunoglobulin structure: partial amino acid sequence of a Bence Jones protein. Science. 1965;147(3663):1304-1305.