1974년 - Tissières 논문: heat shock puff는 단백질 합성으로 이어졌다

염색체 변화에서 단백질 변화로

Ritossa의 1962년 논문이 heat shock response를 염색체 수준에서 보여주었다면, 1974년 Tissières, Mitchell, Tracy의 논문은 그 반응이 실제 단백질 합성 변화로 이어진다는 점을 보여주었습니다.

연구팀의 질문은 분명했습니다. polytene chromosome의 puff가 RNA 합성이 활발한 유전자 부위라면, 그 RNA는 세포질로 나가 단백질로 번역될 것입니다. 그렇다면 열충격으로 새 puff가 나타날 때, 단백질 합성 패턴도 함께 바뀌어야 합니다.

이를 보기 위해 연구팀은 초파리 침샘과 다른 조직을 떼어낸 뒤, 짧은 시간 동안 [35S]methionine을 넣어 새로 합성되는 단백질만 표지했습니다. 이후 SDS-polyacrylamide gel 전기영동과 autoradiography로 어떤 단백질 band가 새로 나타나는지 비교했습니다. 즉, 이 논문은 열충격 반응을 “염색체 모양”에서 “새로 만들어지는 단백질 band”로 옮겨 본 연구였습니다.

발달 과정에서도 단백질 band는 계속 바뀌었다

Tissières 연구팀은 먼저 정상 발달 과정에서 단백질 합성 패턴이 어떻게 바뀌는지 보았습니다. 초파리의 prepupal period, 즉 번데기 형성 전후의 시기는 침샘 염색체 puffing 패턴이 크게 바뀌는 시기였습니다.

흥미롭게도 Coomassie blue로 본 전체 단백질 염색 패턴은 비교적 크게 변하지 않았습니다. 하지만 [35S]methionine으로 새로 합성되는 단백질만 보면 이야기가 달라졌습니다. autoradiograph에서는 시간에 따라 많은 band가 나타났다 사라졌습니다.

논문은 침샘에서 약 22개의 강한 band 또는 peak를 관찰했고, 더 자세히 보면 52개 이상의 서로 다른 이동 거리의 band를 구분할 수 있었다고 보고합니다. 그중 모든 단계에서 보인 band는 하나뿐이었고, 일부 band는 특정 시점에서만 나타났습니다. 이것은 발달 중 특정 유전자 프로그램이 순차적으로 켜지고 꺼진다는 polytene chromosome puff 관찰과 잘 맞았습니다.

열충격은 강한 새 단백질 band를 만들었다

핵심 실험은 heat shock이었습니다. 연구팀은 유충을 37.5°C 물중탕 조건에서 20분 동안 열충격한 뒤, 침샘, 뇌, 말피기관(Malpighian tubules) 등의 조직에서 새로 합성되는 단백질을 비교했습니다.

결과는 매우 뚜렷했습니다. 열충격 후 여러 새 band가 나타났고, 일부 기존 band는 약해졌습니다. 특히 모든 발달 단계와 여러 조직에서 9.5 mm 위치의 매우 강한 band가 즉시 눈에 띄었습니다. 그 밖에도 12, 26, 38, 44, 45.5 mm 부근의 band가 새로 나타났고, 6.5와 16 mm 부근의 약한 band도 관찰되었습니다. 반대로 18, 33, 66, 69 mm 부근의 band는 열충격 뒤 감소했습니다.

논문은 열충격으로 유도된 주요 band들의 표지량을 정량해 표로 제시했습니다. 침샘, 뇌, 말피기관에서 같은 위치의 band가 나타났고, 여섯 개의 주요 band가 전체 표지 단백질의 약 30%를 차지했습니다. 그중 9.5 mm band 하나만으로도 전체 표지의 약 15-19%를 차지했습니다.

이 숫자는 분자량이 아니라, SDS-gel에서 band가 이동한 거리입니다. 당시 연구는 단백질 이름을 알고 시작한 것이 아니라, 전기영동 gel 위에서 “열충격 뒤 새로 강하게 나타나는 band”를 추적하는 방식이었습니다.

중요한 점은 이 반응이 침샘에만 국한되지 않았다는 것입니다. 뇌와 말피기관에서도 같은 특징적 band가 나타났고, polytene chromosome이 없는 날개 imaginal disc에서도 같은 열충격 band가 관찰되었습니다. 성체 초파리의 뇌에서도 비슷한 band가 보였습니다. 따라서 heat shock response는 침샘 거대염색체라는 특수한 구조에만 묶인 현상이 아니라, 여러 조직에서 공유되는 세포 반응으로 보이기 시작했습니다.

HSP라는 이름의 실체

이 논문이 중요한 이유는 heat shock response를 "보이는 염색체 현상"에서 "측정 가능한 단백질 현상"으로 바꾸었기 때문입니다. 이후 HSP70, HSP90, small HSP 같은 단백질군이 분리되고 기능이 규명될 수 있었습니다.

당시에는 아직 molecular chaperone이라는 개념이 완성되지 않았습니다. 그러나 열충격 후 특정 단백질이 대량으로 합성된다는 사실은, 세포가 열로 인해 손상되는 단백질을 보호하거나 복구하는 특수한 시스템을 갖고 있을 가능성을 열었습니다.

puff와 단백질 band는 어떻게 연결되었나

이 논문은 단백질 band만 본 것이 아니라, heat shock 후 puff 부위에서 RNA 합성이 증가하는지도 함께 보았습니다. 연구팀은 [3H]uridine으로 새 RNA 합성을 표지해 염색체 puff 부위의 활성을 관찰했습니다.

열충격 후 염색체의 여러 위치에서 강한 uridine 표지가 나타났고, 그 위치는 당시 Ashburner가 보고한 heat shock-induced puff 위치와 일치했습니다. 특히 3R 염색체의 87B 위치는 다른 부위보다 훨씬 강하게 표지되었습니다. 동시에 단백질 gel에서는 9.5 mm band가 다른 band보다 훨씬 강하게 나타났습니다.

연구팀은 이 두 관찰을 연결해, 9.5 mm band가 87B locus에서 만들어진 mRNA에 의해 암호화되었을 가능성을 제시했습니다. 또한 87A와 67B 같은 다른 강한 puff 부위가 46 mm와 38 mm band와 연결될 수 있다고 조심스럽게 추정했습니다.

물론 이 연결은 오늘날의 유전자 클로닝이나 단백질 동정처럼 확정적인 증거는 아니었습니다. 연구팀도 특정 puff와 특정 polypeptide band의 직접 대응은 circumstantial, 즉 정황적 증거라고 조심스럽게 표현했습니다. 하지만 그 정황은 매우 강했습니다. 열충격으로 puff가 생기고, 그 puff에서 RNA 합성이 늘고, 동시에 특정 단백질 band가 폭발적으로 나타났기 때문입니다.

이후 연구로 이어진 질문

이 논문 이후 HSP 연구의 질문은 더 구체적으로 바뀌었습니다. 이 단백질들은 왜 열에 반응해 증가하는가? 단백질 접힘을 돕는가? 손상 단백질 응집을 막는가? 평상시에도 필요한가?

이 질문들이 쌓이면서 HSP는 단순한 스트레스 표지가 아니라, 단백질 품질관리와 세포 생존의 핵심 샤페론 네트워크로 이해되었습니다.

References

1. Tissières A, Mitchell HK, Tracy UM. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs. J Mol Biol. 1974;84(3):389-398.
2. Ritossa FM. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila. Experientia. 1962;18:571-573.