이 실험법은 면역학을 이해하기 위한 간략한 설명이며, 보다 자세한 설명은 관련 책을 참고하시기 바랍니다.
실험방법법
- 마우스 희생 : 마취한후 쥐를 죽이고 각 쥐의 왼쪽 등 쪽을 70% 에탄올로 적신다.
- 페트리 디쉬 준비 : 멸균된 페트리디쉬 접시에 철망 스크린을 넣고, 피펫으로 10mL의 HBSS를 넣는다. 페트리디쉬에 라벨을 붙인다.
- 비장 제거 : 무균적으로 비장을 제거하고 철망 스크린이 있는 페트리 디쉬 로 옮긴다. 비장을 철망 스크린 중앙에 놓는다.
- 비장세포 분산 : 10mL 주사기의 플런저를 사용하여 비장을 철망을 통해 부드럽게 눌러 비장 세포를 분산시킨다. 비장 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브로 옮긴다. 큰 덩어리가 가라앉을 때까지 1분간 기다린 후, 세포 현탁액을 (침전물을 방해하지 않고) 새로운 15mL 튜브로 옮긴다.
- 원심분리로 세포 세척 : 세포를 200 × g에서 10분간 원심분리한다. 상층액(상징액)을 버리고 세포를 3mL의 HBSS에 재현탁한다.
- 세포수 계수 : 15mL 원심분리 튜브에 5mL의 HBSS에 비장 세포 현탁액을 1:100으로 희석하여 계수 및 세포 생존율을 결정한다.
7-9단계는 튜브 내의 soft-agarose가 굳는 것을 방지하기 위해 신속하게 수행해야 한다. - 멸균된, 눈금이 있는 스퀴저(일종의 스포이드)를 사용하여 45°C water bath에서 아가로즈 4mL(0.7%)가 들어 있는 각각의 7개 튜브에 20% SRBC 현탁액 0.25mL를 넣는다.
- 멸균된 1mL 유리 피펫을 사용하여 비장 현탁액 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.8mL를 7개의 튜브에 각각 넣고 적절하게 라벨을 붙인다 (예: 튜브 #1, 0.1mL; 튜브 #2, 0.2mL; 튜브 #3, 0.3mL 등). 튜브를 캡으로 닫고 2-3번 뒤집어 섞는다. 피펫으로 섞지 말고 거품이 생기지 않도록 한다.
- Agar(한천)-SRBC-비장 세포 혼합물을 부드럽게, 그러나 신속하게 페트리디쉬(agar가 깔려 있는 페트리디쉬임)에 부어주고, 아가 표면을 고르게 덮도록 조심스럽게 움직여준다.
- 아가가 굳을 때까지 기다린 후, 희석된 보체를 1.5mL 접시에 추가한다. 페트리디쉬를 37°C 인큐베이터(습도가 유지되는)에서 1시간 동안 배양한다.
- 1시간 후, 접시에서 플라크의 존재 여부를 확인한다. 플라크가 뚜렷하지 않은 경우, 접시를 실온에서 15-30분간 두었다가 다시 플라크를 관찰한다.
